在日常操作中,我们可能借助Excel这样的工具,通过多项式曲线拟合ELISA数据,辅助我们快速确定样品浓度。而在更专业的GraphPad Prism软件中,数据导入更为便捷,只需新建项目,定义列类型,输入标准品和样品的吸光度值,软件会自动进行数据处理和统计图表生成,如柱状图和折线图,帮助我们直观地展示数据趋势。
竞争法是一种较少用到的ELISA检测机制,一般用于检测小分子抗原,将具有专一性的抗体固著于塑胶孔盘上,完成后洗去多余抗体;加入待测检体、带有酶的抗原,与塑胶孔盘上的抗体专一性键结。塑胶孔盘上固著抗体数量有限,检体中抗原量越多,带有酶的抗原可键结固著抗体就越少。
Elisa法有间接ELISA和直接ELISA两种类型。其中,直接ELISA又分为竞争ELISA和非竞争ELISA两种。其原理均基于抗体与其对应的抗原之间的特异性结合,利用这一结合来检测样品中是否含有特定的抗原。
让我们一起深入探究这四种类别:直接法、间接法(放大效应)、夹心法(提升灵敏度与特异性)和竞争法(在复杂样本中大显身手)的奥秘。ELISA的科学基础/: 作为免疫检测的基石,ELISA涉及非特异性吸附,但通过酶标记技术,能够定量地解读与目标的结合强度。
1、直接法(direct ELISA)将抗原直接固定在固相载体上,加入酶标记的一级抗体,即可测定抗原总量,此一级抗体的特异性非常重要。优势:操作手续简短,因无须使用二抗可避免交互反应。缺点:试验中的一抗都得用酶标记,但不是每种抗体都适合做标记,费用相对提高。
2、直接法(direct ELISA)将抗原直接固定在固相载体上,参加酶符号的一级抗体,即可测定抗原总量,此一级抗体的特异性非常重要。优势:操作手续简略,因无须运用二抗可防止交互反响。缺陷:实验中的一抗都得用酶符号,但不是每种抗体都适合做符号,费用相对进步。
3、ELISA实验所有方法的缺点很明显:重复性不好;收自身抗体、嗜异性抗体等干扰,易出现假阳性;不论仪器和手工操作,干扰因素较多。影响最大的是温度和时间。
4、定量检测体液中抗原或抗体成份。酶联免疫吸附试验法以其灵敏度高(可达 ng 甚至pg 水平),特异性好等优点,在生命科学各领域得到广泛应用,它已迈出医药、临床领域,步入农业、渔业、畜牧业和食品加工业。
5、在实际应用中,通过不同的设计,具体的方法步骤可有多种。即:用于检测抗体的间接法(图a)、用于检测抗原的双抗体夹心法(图b)以及用于检测小分子抗原或半抗原的抗原竞争法等等。比较常用的是ELISA双抗体夹心法及ELISA间接法。